Kira-kira 6,000 tahun yang lalu, sesetengah daripada pusat pertanian di lembangan ini berkembang menjadi kota-kota terawal di dunia. Dalam tempoh antara 4000 dan 3100 SM, Mesopotamia mempunyai satu jaringan negara kota yang saling bersaing antara satu sama lain iaitu:
- Kota Ur
- Kota Uruk
- Kota Babil
- Kota Akkad
- Kota Ashur
- Kota Nimrud; dan
- Kota Nineveh
Pada satu tahap, negara-negara kota ini disatukan di bawah Empayar Akkad oleh Raja Sargon I. Empayar ini seterusnya berpecah dua menjadi dua empayar iaitu:
- Empayar Asyur
- Empayar Babil
